基因编辑动物的明星无角牛遇到了麻烦。

图 | 基因编辑而来的无角牛（来源：麻省理工科技评论）

美国 FDA 的科学家研究了 Recombinetics 公司经由基因编辑得到的一头无角牛，结果发现，这头名为 Buri 的公牛体内存在一段细菌 DNA，是具有抗生素抗性的基因片段。FDA 称，这是一段在基因编辑过程中无意添加进去的基因片段。

此前，该公司宣称这头牛是百分百的牛，并指责 FDA 不应该对这类动物进行监管。

据《麻省理工科技评论》报道，Recombinetics 子公司 Acceligen 的首席执行官 Tad Sontesgard 表示，这个是无意的非预期结果，公司应该做一个完整的检查。

此次质粒污染事件，可能让 Recombinetics 这家明星创业公司陷入大麻烦，但对于基因编辑产业的健康发展是个良性的提醒。

质粒 DNA 污染的发现

这是基因编辑操作过程导致的 DNA 污染。

7 月 28 日，美国 FDA 的科学家 Alexis L. Norris 和 Stella S. Lee 在预印本 bioRxiv发表题为《在基因组编辑种系牛中发现质粒模板》一文。研究人员分析了来自该牛的全基因组测序数据，在靶位点发现了质粒和第二个修复模板 DNA 序列的杂交整合。

FDA 研究人员发现，两头基因编辑牛中都存在全长的质粒骨架。在两头牛中，虽然一个等位基因产生了预期的编辑结果，但另一个等位基因的靶位点处发现质粒与修复模板序列的重组。

图 | 修复模板和质粒整合在牛基因编辑的靶位点。图 a 为模板质粒，图 b 为未经编辑的亲本细胞系，图 c 为编辑过的牛基因结构。（来源：bioRxiv）

论文称，此前科学研究发现过哺乳动物基因编辑实验中靶点处出现了复杂的基因组重排现象，而这种现象通过常规的 PCR 和 DNA 测序方法难以检测出来。

Recombinetics 公司于 2013 年使用了质粒进行基因编辑操作，即将携带基因编辑工具 TALENs 和涉及无角的基因变异的质粒植入细胞，编辑后的细胞用于克隆，之后就产生了两头无角牛 Buri 和 Spotigy。

具体而言，通过 TALENs，以无角安格斯牛 1 号染色体上重复 212 碱基对替代了原来细胞染色体上 10 个碱基对的重复序列，得到了经基因编辑的荷斯坦牛胎儿成纤维细胞。随后通过体细胞核移植技术成功获得了基因编辑无角荷斯坦奶牛。通过检测，这些基因编辑牛都无角，且不存在其他症状。

这两头牛于 2015 年出生，一时间成为各大国际媒体报道的宠儿。Spotigy 被杀死以分析其组织，Buri 则繁衍了 17 个后代。

尽管相比目前的其他育种技术，基因编辑技术更为精确，但一直以来，有对基因编辑可预测性和可靠性的担心。Recombinetics 公司一直宣称，他们确切知道基因应该去哪里以及其所在的位置，并拥有基因编辑没有脱靶的证据。与此同时，该公司认为 FDA 对基因编辑动物产品以新药开发的模式进行监管不合理，因此一直呼吁 FDA 豁免其基因编辑产品的监管。

如今科学家认识到，基因编辑可能产生错误。即使是其他基因编辑技术，如锌指核酸酶（ZFN）技术也已经发现模板质粒整合事件在靶位点和非靶位点都有发生，还有研究发现，CRISPR/Cas9 编辑的秀丽线虫靶位点处发现模板质粒的整合。

FDA 负责动物生物工程的 Heather Lombardi 表示，当研究人员使用基因编辑技术制造 DNA 断裂时，细胞会启动自我修复机制，理想状态下，它会正确修复，但实际上细胞可以整合任何靶点附近的 DNA。

污染的风险有多大

质粒 DNA 污染意味着什么呢？根据转基因生物产品的定义，只要产品中出现质粒 DNA，那么就意味着这种产品应该被视作转基因产品。

那么在 Buri 的 17 个后代中，差不多一半的牛体内会含有这种质粒 DNA。

含有质粒 DNA 的牛肉能吃吗？Tad Sontesgard 认为，无论有没有质粒，这些牛的肉都是可以食用的。加州大学戴维斯分校兽医科学家 Alison Van Eenennaam 也说，这种无角牛即使有质粒 DNA 污染，也不必担心食品安全问题。

事实上，科学共识也是这么说的，吃了转基因食品并不会转变进食者的基因与健康状况。《麻省理工科技评论》则指出，需要关心的是，牛体内的细菌会不会受到这些抗生素抗性基因的影响，以及这些基因会不会散播出去。

Tad Sonstegard 承认，Acceligen 公司没有提早发现质粒在无角牛体内的存在，但承诺现在会专门设置此筛查程序。

据美国非营利机构“新食品经济”（New Food Economy）报道引述 Heather Lombardi 的看法称，基因编辑技术是一种新兴的技术，仍处于改进完善的进程中，它很可能会额外产生非预期且不易察觉的错误。虽然这些错误可能不会带来额外的风险或安全问题，但人们需要盯紧以尽量避免。

无角牛前路不乐观

此前的媒体报道中，Recombinetics 公司无角牛代表着人道主义。

牛角本来是用来御敌的，但在如今的农场里，牛角就失去了历史上的作用。相反，牛角常常会对其他牛或养殖工人造成伤害，于是农场主都会给幼牛进行去角处理，大都是直接削去幼牛头上的嫩角，然后灼烧止血。可以想象，幼牛的痛苦是非人道的，另外这种处理的成本也很高。所以，如果能培育一种无角牛，对农场主和普通民众都是众望所归。

科学家发现，某些天然无角品种的牛是因为两个基因中的任意一个发生了突变，即凯尔特牛的 Pc 基因和荷斯坦牛的 PF 基因。而常规育种来实现无角牛所花费的成本太高，加上奶牛需要综合最大产奶潜力、健康、体格稳健以及可育性等多种因素，如果想通过选择育种得到无角奶牛，就需要用很多代杂交过程来实现，这是养殖者无法负担的。

基因编辑技术正是科学家相中的最得力工具。在 Recombinetics 得到 Buri 和 Spotigy 后，按照育种程序就该选育出优良的基因编辑公牛品种，通过常规杂交将 Pc 等位基因传播到全球。

2016 年，明尼苏达州圣保罗市的 Recombinetics 向 FDA 提出申请，希望得到无角牛的监管豁免。该公司称无角牛是一种自然出现的突变，而无角牛仅仅利用基因编辑技术关闭了其中一个基因。但 FDA 拒绝了这项申请。

于是 Recombinetics 决定寻找美国之外的市场，他们获得了巴西监管机构的「绿灯」。只是这次质粒污染事件对于 Recombinetics 公司的无角牛是严重打击，意味着相关研究告一段落，其前途陷入渺茫。同时，巴西监管机构宣布，拒绝该公司相关产品的申请。

专访中科院遗传与发育研究所高级工程师姜韬：不必夸大质粒污染的影响

DeepTech：FDA 研究人员分析了来自该牛的全基因组测序数据，在靶位点发现了质粒和第二个修复模板 DNA 序列的杂交整合。那么这种非预期结果在基因编辑过程中出现频繁吗？以及可能有哪些原因导致这样的结果呢？

姜韬：我们知道，基因编辑过程中必然有 DNA 切断的过程，然后利用细胞自身的重组机制连接起来，确保染色体的完整性，以在细胞分裂时遗传给子代细胞。

细胞自主的重组过程有一定的不可控性，就是有可能将染色体断裂部位附近的 DNA 分子随机连接起来整合到染色体中。如果在基因编辑时，存在线性化的质粒 DNA，那就难免这些质粒 DNA 也会被连接起来重组到基因组中。

之所以会有这个问题，是因为对进行基因编辑的细胞进行遗传转化时，往往需要带入表达基因载体——利用细胞本身来表达基因组编辑必需的工具酶，也就是质粒。这个现象是有一定概率发生的，好在事后可以清楚地鉴定出来，甚至淘汰掉这种个体。

DeepTech：论文说，常规检测难以发现这样的质粒整合，这是说常规 PCR 检测存在漏洞吗？为何这个漏洞之前没有被重视？

姜韬：原文这个说法站不住脚，质粒 DNA 序列是完全清楚的，非常容易通过常规 PCR 检测出来，除非是研发者没有做这个检测。

DeepTech：如果要预防这样的结果出现，目前有哪些解决方案吗？

姜韬：即使发生了质粒整合，很容易检测出来，事后处理也很简单。目前用于大肠杆菌基因编辑的商业试剂盒，早就有消除质粒技术了。至于是否会一开始就能彻底避免，需要基因编辑的研发者们攻关了。

如今已经有的瞬时表达技术，在质粒表达完核酸酶之后，质粒 DNA 被迅速降解，那么也就没有机会整合到细胞基因组，甚至还可以通过基因枪直接将在体外组装的核糖核蛋白复合体输送到细胞中进行编辑。只有直接注射进现成蛋白质酶分子，而不用借助细胞来表达工具酶的，才可以彻底避免质粒 DNA 的插入。

DeepTech：植物的基因编辑会不会遇到类似的问题？

姜韬：只要是转化基因编辑的细胞，要利用这个细胞做宿主来表达外源基因，就有一定概率发生非同源重组，整合进非预期的质粒 DNA。这与编辑的基因是微生物或者动植物都没有关系。

DeepTech：如何看待 Recombinetics 公司这次遇到的麻烦，以及这个事件可能带给基因编辑应用发展的影响？还有，这个事件会给基因编辑在各国的监管带来怎样的影响？

姜韬：鉴于上面理由，我认为对基因编辑产业不会有什么影响。只需要认真做好事后检测和处理就可以了。当然，监管部门可以强制基因编辑生物制造单位做这种检测和处理，以避免在分子水平上产生非预期的生物体。

参考文献：

https://www.biorxiv.org/content/10.1101/715482v1.full

https://www.technologyreview.com/s/614235/recombinetics-gene-edited-hornless-cattle-major-dna-screwup/

https://newfoodeconomy.org/fda-gene-edited-cattle-antibiotic-resistant-crispr-dna/

https://theecologist.org/2019/aug/21/antibiotic-resistance-gene-edited-cattle

https://www.nature.com/articles/d41586-019-00600-4

http://www.nytimes.com/2015/11/27/us/2015-11-27-us-animal-gene-editing.html